Tris-Tricine-PAGE凝膠制備及電泳試劑盒（適用于多肽電泳） 說明書Ver
740056
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貨號(hào)
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名稱
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規(guī)格
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RTD6122
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Tris-Tricine-PAGE凝膠制備及電泳試劑盒
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25次
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● 產(chǎn)品組成：
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序號(hào)
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組分貨號(hào)
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名稱
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規(guī)格
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貯存
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1
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RTD6122-01
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2×濃縮膠緩沖液
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20
ml
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4℃
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2
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RTD6122-02
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2×分離膠緩沖液
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65
ml
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4℃
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3
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RTD6122-03
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2×濃縮膠聚合溶液
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20
ml
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4℃
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4
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RTD6122-04
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2×分離膠聚合溶液
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65
ml
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4℃
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5
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AP020P
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10% APS（干粉）
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5 ml
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常溫
配制后-20℃
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6
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TA0761-01
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TEMED
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0.5
ml
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常溫
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7
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CB010P
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10×Tris-Tricine-SDS緩沖液
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500
ml(干粉)
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常溫
配制后4℃
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8
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TP050-01
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2×Tricine上樣緩沖液(變性,還原)
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1
ml
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-20℃
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● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
該產(chǎn)品含有多肽電泳全套試劑，可以用來檢測(cè)2.5-20
kD的多肽大小。本試劑盒可配制至少25塊常規(guī)大?。?×10cm）,厚度1 mm的PAGE膠。該產(chǎn)品具有以下特點(diǎn)：
1 分辨率高：凝膠緩沖液獨(dú)特配方，可以有效分離2.5-5 kD多肽；
2 使用方便：配制凝膠時(shí)只需1:1混合濃縮膠或分離膠溶液，不用計(jì)算；
3 易于上樣：紅色濃縮膠，易于觀察加樣孔，上樣方便。
● 貯存、運(yùn)輸及效期：
按照標(biāo)簽溫度貯存；常溫運(yùn)輸；有效期一年。
● 使用說明：
一. 10%APS溶液配制：
10%
APS為固體粉末，使用前加入5 ml雙蒸水溶解即配制成10% APS溶液，將溶液分裝后置于-20℃保存，通常一年內(nèi)有效。該溶液在4℃條件下可以穩(wěn)定保存兩周。若發(fā)現(xiàn)凝膠聚合時(shí)間延長(zhǎng)，應(yīng)考慮更換使用-20℃保存的10% APS溶液。
二. 制膠：
1. 配制分離膠:
1.1按照表一將不同體積的成分加入到小燒杯中混合；立即混勻5-10秒，以使溶液充分混勻。 表1
（一塊1 mmmini膠用量）*
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分離膠
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濃縮膠
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18％T
/5 ml
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5％T
/1.5 ml
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2×濃縮膠緩沖液
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/
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0.75 ml
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2×分離膠緩沖液
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2.5 ml
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/
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2×濃縮膠用聚合溶液
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/
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0.75 ml
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2×分離膠用聚合溶液
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2.5 ml
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/
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10%APS溶液
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~50 μl
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~15 μl
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TEMED
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~5 μl
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1.5 μl
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注： * 如非必須，不要使用厚度1.5 mm的凝膠，盡量使用厚度1 mm的凝膠，這樣會(huì)減少電泳后染色和脫色的時(shí)間。
1.2 在玻璃板中迅速灌入適量分離膠溶液，使液面和短玻璃板上沿之間的距離比梳齒長(zhǎng)0.5
cm即可。注：此溶液為過量，請(qǐng)勿全部注入。
1.3
然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-2 cm的無水乙醇層，使凝膠表面保持平整。
1.4 靜置10-30分鐘，待分離膠和乙醇層之間出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面表示凝膠已聚合。
注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)?？梢愿鶕?jù)表1的標(biāo)準(zhǔn)條件調(diào)節(jié)促凝劑的加入量。分離膠25℃條件下，約20分鐘可以聚合。
2. 配制濃縮膠:
去除覆蓋在分離膠上的乙醇層，用濾紙將殘留的乙醇吸去。
2.1 按照表一將不同成分加入到小燒杯中混合；立即混勻5-10秒，以使溶液充分混勻。
2.2 將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。
2.3 靜置30-50分鐘待凝膠聚合。
注：凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí)，聚合較快；冬天氣溫低時(shí)，聚合時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)。可以根據(jù)表1的標(biāo)準(zhǔn)條件調(diào)節(jié)促凝劑的加入量。濃縮膠25℃條件下，約40分鐘可以聚合。
三. 電泳：
3.1 變性電泳緩沖液和樣品配制：
3.1.1 10×Tris-Tricine-
SDS緩沖液配制：
將10×Tris-Tricine -SDS緩沖液（10×TTS）粉末（Cat No：CB010P）置于一干凈的燒杯中，加入500 ml超純水，徹底攪拌混勻，不要調(diào)節(jié)pH，即配成500ml 10×TTS緩沖液。超純水稀釋10倍配成1×Tris-Tricine
-SDS緩沖液。
注：伯樂Mini III電泳槽一次電泳使用300-350 ml 1×TTS緩沖液。
3.1.2 變性樣品處理：
待上樣的檢測(cè)樣品與2×Tricine上樣緩沖液（變性，還原）[Cat No：TP050]等體積混合，95℃處理5分鐘后上樣。蛋白Marker一般已經(jīng)含有上樣緩沖液，根據(jù)說明書上樣（預(yù)染Marker不能加熱處理，非預(yù)染Marker上樣前一般要95℃處理5分鐘）。
3.2 非變性電泳緩沖液配制和樣品配制：
3.2.1 10×Tris-Tricine緩沖液配制：
將10×Tris-Tricine緩沖液（10×TT）粉末[Cat No:CB020P]（試劑盒不提供）置于一干凈的燒杯中，加入500 ml超純水，徹底攪拌混勻，不要調(diào)節(jié)pH，即配成500 ml 10×TT緩沖液。超純水稀釋10倍配成1×Tris-Tricine緩沖液。
注：伯樂Mini
III電泳槽一次電泳使用300-350 ml 1×TT緩沖液。
3.2.2 非變性樣品處理：
待上樣的檢測(cè)樣品與2×Tricine上樣緩沖液（非變性，非還原）[Cat No:TP070]
（試劑盒不提供）等體積混合，不要加熱，直接上樣。
3.3 電泳：
將電泳槽的內(nèi)槽加滿電泳緩沖液，輕柔拔出梳子，用1 ml移液器將梳孔吹洗干凈，將Marker或蛋白樣品加入點(diǎn)樣孔，穩(wěn)壓電泳（表2），至藍(lán)色考馬斯亮藍(lán)指示前沿至分離膠下沿位置時(shí)即可停止電泳。整個(gè)電泳過程大約需要2.5-3個(gè)小時(shí)。
表2 多肽電泳條件
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恒電壓
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150 V
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起始電流
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60-75
mA/板膠
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結(jié)束電流
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15-25
mA/板膠
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電泳時(shí)間
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2.5-3小時(shí)
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注：穩(wěn)壓電泳，電流不用調(diào)節(jié)，記錄電流數(shù)值在推薦范圍內(nèi)，電泳過程中電流會(huì)逐漸降低。
四. 染色：
凝膠可以使用常規(guī)考馬斯亮藍(lán)染色液和脫色液進(jìn)行染色和觀察。需要注意的是，常規(guī)染色和脫色方法需要較長(zhǎng)時(shí)間，小肽由于長(zhǎng)度較短，和凝膠結(jié)合不緊密，長(zhǎng)時(shí)間在溶液中浸泡容易從凝膠中脫離。常規(guī)染色和脫色時(shí)效果不好或考慮其毒性，請(qǐng)選擇本公司的FastBlue蛋白染色液（Cat No：RTD6202），該產(chǎn)品除具有染色快，無毒，靈敏性高等特點(diǎn)外，還能對(duì)小肽在染色中起到固定作用，不至于小肽在染色和脫色中從凝膠中脫離，是常規(guī)染色液的理想替代品。
實(shí)驗(yàn)示例：
多肽電泳配套試劑