Nature Communications [2023 IF14.7 ]南京農(nóng)業(yè)大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)使用植物原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化試劑盒（目錄號(hào)：RTU4072）發(fā)表文章
《Nature Communications》發(fā)表棉花遺傳育種團(tuán)隊(duì)“Re-localization of a repeat-containing fungal effector by apoplastic protein Chitinase-like 1 blocks its toxicity”
病原真菌是世界范圍內(nèi)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要威脅之一。2022年，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）報(bào)道全球168種作物受到數(shù)百種真菌病害的影響。黃萎病菌（Verticillium dahliae）是一種土壤傳播、半活體營(yíng)養(yǎng)型的絲狀真菌。它通過根部侵染，在維管系統(tǒng)中定殖，導(dǎo)致寄主出現(xiàn)萎蔫癥狀，進(jìn)而引發(fā)包括棉花在內(nèi)的多種作物發(fā)生黃萎病，嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)。由于化學(xué)殺菌劑很難有效控制黃萎病危害，培育抗病品種是經(jīng)濟(jì)可行的最有效途徑。眾所周知，病原菌會(huì)產(chǎn)生大量效應(yīng)因子抑制植物免疫防御，或產(chǎn)生毒素直接誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，促進(jìn)其感染。發(fā)掘黃萎病菌關(guān)鍵效應(yīng)蛋白，開展基于病菌效應(yīng)蛋白的寄主互作靶標(biāo)鑒定與育種利用是提高作物抗病性的重要策略之一。
近日，棉花遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新利用團(tuán)隊(duì)在國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊Nature Communications在線發(fā)表了題為“Re-localization of a repeat-containing fungal effector by apoplastic protein Chitinase-like 1 blocks its toxicity”的研究論文。該研究鑒定到一個(gè)具有獨(dú)特串聯(lián)重復(fù)DOMAIN的新型真菌毒性蛋白VdTRP并揭示了其致病機(jī)制；解析了棉花一個(gè)細(xì)胞壁關(guān)鍵蛋白類幾丁質(zhì)酶CTL1在質(zhì)外體與VdTRP互作，阻止VdTRP靶向細(xì)胞膜誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的抗病機(jī)制；提出基于病菌毒蛋白的寄主互作靶標(biāo)關(guān)鍵基因發(fā)掘及提高作物抗病性的育種利用策略。
為了促進(jìn)寄主植物的定殖和感染，病原真菌產(chǎn)生大量的效應(yīng)因子來調(diào)節(jié)寄主生理或逃避寄主細(xì)胞的識(shí)別。與細(xì)菌效應(yīng)子通過III型分泌系統(tǒng)注入植物細(xì)胞不同，真菌效應(yīng)因子既可在質(zhì)外體也可進(jìn)入植物細(xì)胞發(fā)揮毒性作用。據(jù)估計(jì)，導(dǎo)致作物黃萎病的大麗輪枝菌可編碼700多種分泌型效應(yīng)蛋白。雖然部分效應(yīng)蛋白功能已被報(bào)道，然而迄今為止，大部分效應(yīng)蛋白功能仍然未知。
本研究從海島棉H7124誘導(dǎo)黃萎病菌強(qiáng)致病力菌株V991的轉(zhuǎn)錄組中鑒定到一個(gè)顯著被根組織誘導(dǎo)表達(dá)的新型毒素蛋白，命名為VdTRP。該蛋白結(jié)構(gòu)包括一段信號(hào)肽序列、一個(gè)非典型的真菌胞外膜蛋白（CFEM）結(jié)構(gòu)域、一個(gè)新型的富含脯氨酸基序(IPGGCNPAHPGSCP)組成的四肽串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)域、和一段C端基序。農(nóng)桿菌瞬時(shí)侵染試驗(yàn)表明，VdTRP可以快速且強(qiáng)烈的造成煙草、棉花和擬南芥葉片細(xì)胞死亡。而敲除VdTRP的V991突變菌株則顯著降低了對(duì)棉花的致病力。研究表明，類CFEM結(jié)構(gòu)域和四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域?qū)?/span>VdTRP的致毒性缺一不可。缺失類CFEM結(jié)構(gòu)域減弱了VdTRP對(duì)煙草細(xì)胞的毒性，而缺失富含脯氨酸的四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域?qū)е?/span>VdTRP對(duì)煙草細(xì)胞的毒性完全喪失。氨基酸突變分析表明脯氨酸作為重要位點(diǎn)發(fā)揮關(guān)鍵的毒力作用，同時(shí)富含脯氨酸基序的串聯(lián)重復(fù)數(shù)目與細(xì)胞的毒性程度顯著相關(guān)。亞細(xì)胞定位顯示VdTRP定位于細(xì)胞膜，類CFEM結(jié)構(gòu)域是VdTRP細(xì)胞膜定位的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。體外脂結(jié)合試驗(yàn)證明，VdTRP的類CFEM結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞膜成分PS（磷脂酰絲氨酸）結(jié)合。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，純化的VdTRP蛋白可以造成體外培養(yǎng)的H9c2大鼠心肌細(xì)胞死亡。掃描離子電導(dǎo)顯微鏡（SICM）的表面形貌檢測(cè)與電荷同步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，VdTRP導(dǎo)致H9c2細(xì)胞表面穿孔，發(fā)生離子泄露。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明VdTRP通過類CFEM結(jié)構(gòu)域與PS結(jié)合靶向細(xì)胞膜，富含脯氨酸的四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域發(fā)揮毒力作用使細(xì)胞膜穿孔，發(fā)生離子泄露，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
為了發(fā)掘棉花中可能抵抗VdTRP毒蛋白的靶標(biāo)，研究進(jìn)一步通過酵母雙雜篩庫(kù)結(jié)合多種蛋白互作手段證明VdTRP與棉花的類幾丁質(zhì)酶CTL1在體內(nèi)外均相互作用。酵母雙雜分段實(shí)驗(yàn)、GST pull down實(shí)驗(yàn)和微量熱泳動(dòng)分子互作實(shí)驗(yàn)證明，CTL1主要和VdTRP的C端基序互作。 CTL1定位于質(zhì)外體，VdTRP定位于細(xì)胞膜。然而，在煙草中共同表達(dá)CTL1和VdTRP蛋白，VdTRP細(xì)胞膜定位改變?yōu)橘|(zhì)外體定位，同時(shí)VdTRP誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的程度減緩。相反，在煙草中共同表達(dá)CTL1和缺失C端基序的VdTRP△C-terminal時(shí)，VdTRP△C-terminal的細(xì)胞膜定位沒有改變，且VdTRP△C-terminal誘導(dǎo)細(xì)胞壞死程度也未明顯減弱。這些結(jié)果表明CTL1可以在質(zhì)外體與VdTRP的C端基序互作，阻止其靶向細(xì)胞膜誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，進(jìn)而提高植株抗病性。
研究發(fā)現(xiàn)，CTL1并不具有幾丁質(zhì)酶活性，對(duì)大麗輪枝菌也沒有抑菌作用。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)表明，在陸地棉中過量表達(dá)CTL1則顯著增強(qiáng)了植株體內(nèi)糖代謝水平，增加了本底水楊酸含量并減緩了VdTRP對(duì)棉花的毒性，顯著提高了棉花對(duì)黃萎病的抗性。然而，RNAi干擾CTL1的轉(zhuǎn)基因棉花則表現(xiàn)為植株生長(zhǎng)發(fā)育嚴(yán)重影響，無法完成生長(zhǎng)周期，獲得后代。利用VIGS技術(shù)沉默CTL1，發(fā)現(xiàn)CTL1沉默的棉花植株出現(xiàn)細(xì)胞壁缺陷，莖“脆桿”和根發(fā)育減弱的表型。這些結(jié)果表明CTL1是棉花生長(zhǎng)發(fā)育的必需基因。
綜上所述，本研究揭示了棉花生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵因子類幾丁質(zhì)酶CTL1參與黃萎病抗性的分子機(jī)制。CTL1在質(zhì)外體與黃萎病菌新型毒性蛋白VdTRP相互作用，阻止VdTRP靶向細(xì)胞膜，減緩其對(duì)植株細(xì)胞膜毒性；過量表達(dá)CTL1顯著增強(qiáng)植株體內(nèi)糖代謝水平，激發(fā)植物細(xì)胞受體蛋白/激酶類基因上調(diào)表達(dá)，觸發(fā)SA的合成并激活自身的免疫反應(yīng)。研究為培育棉花抗病新品種提供了理論基礎(chǔ)和基因資源。
質(zhì)外體蛋白CTL1阻止新型毒蛋白VdTRP破壞細(xì)胞膜，誘導(dǎo)植株提高免疫，增強(qiáng)棉花對(duì)黃萎病抗性的工作模式圖
利用VdTRP中IPGGCNPAHPGSCP重復(fù)基序?yàn)樘结槪褜す矓?shù)據(jù)庫(kù)中不同類型真菌基因組序列，發(fā)現(xiàn)該基序在盤菌亞門中糞殼菌綱、座囊菌綱、錘舌菌綱和散囊菌綱等253種真菌中均保守存在，其重復(fù)數(shù)目從1-15不等。選擇三種不同來源的效應(yīng)蛋白進(jìn)行毒性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)均導(dǎo)致不同程度植株葉片萎焉。其中灰葡萄孢菌XP-001561412和VdTRP結(jié)構(gòu)相似性高，含有信號(hào)肽、GPI膜錨定結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸的重復(fù)基序，該效應(yīng)蛋白致毒性強(qiáng)，對(duì)煙草細(xì)胞造成嚴(yán)重壞死。上述結(jié)果表明富含脯氨酸的重復(fù)基序在多種病原真菌的效應(yīng)蛋白中具有相似的致毒作用，含有膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)蛋白致毒性更高。
很多細(xì)菌、真菌和卵菌在侵染植物過程中都會(huì)分泌一種引發(fā)細(xì)胞凋亡的蛋白類毒素，這類毒素蛋白的發(fā)現(xiàn)與機(jī)理解析正越來越受到大家關(guān)注。針對(duì)前人廣泛關(guān)注的壞死和乙烯誘導(dǎo)型蛋白NLP1，團(tuán)隊(duì)前期鑒定到過氧化物酶體定位的溶血磷脂酶GhLPL2，可抑制黃萎病菌毒素蛋白VdNLP1的毒力作用（Wang et al., 2023, The Plant Journal）。本研究鑒定了一個(gè)具有獨(dú)特串聯(lián)重復(fù)DOMAIN的黃萎病菌新型毒性蛋白，進(jìn)一步解析了棉花類幾丁質(zhì)酶CTL1可作為靶標(biāo)阻止病菌毒蛋白侵染的抗病機(jī)制。GhLPL2和CTL1均是棉花生長(zhǎng)發(fā)育的必需因子。這兩項(xiàng)研究的發(fā)現(xiàn)表明，植物可通過調(diào)控必需基因的表達(dá)，抵御蛋白毒素類效應(yīng)因子對(duì)細(xì)胞的毒性，顯著提高黃萎病抗病性。這是不同于PTI 和ETI免疫通路的另外一種提高作物抗病性的新策略。
實(shí)驗(yàn)室博士研究生柳漢橋為論文第一作者，郭旺珍教授和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王心宇教授為論文共同通訊作者。已畢業(yè)碩士研究生張文姝參與了VdTRP敲除與恢復(fù)突變體創(chuàng)制與鑒定工作，已畢業(yè)博士研究生何慶飛、碩士研究生熱衣拉·艾克木和許慧娟參與了轉(zhuǎn)基因棉花創(chuàng)制工作。在讀博士研究生郭展、王璐，鐘山青年研究員李維希博士和王桂林博士也參與了部分研究工作。南京醫(yī)科大學(xué)陳峰副教授和博士研究生宋瑤在SICM實(shí)驗(yàn)中提供了大量幫助。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院王燕教授和竇道龍教授，實(shí)驗(yàn)室李珊教授和張群教授，動(dòng)物醫(yī)學(xué)院郭大偉教授在本研究完善過程中提供了建議和幫助。該研究得到農(nóng)業(yè)生物育種國(guó)家科技重大專項(xiàng)、江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃和江蘇現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心等項(xiàng)目資助。
文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-54470-0
文章中擬南芥原生質(zhì)體的提取和轉(zhuǎn)化使用了RTU4072 植物原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化試劑盒。